PAβNは、MexBの空洞で3通りの姿をとる
クライオ電顕と結晶構造でMexB・PAβN複合体を解析し、阻害剤の通り道を探った
- 疑問・課題
- PAβNは薬剤排出ポンプの阻害剤の基準だが、毒性が強いとされ、MexBとの結合様式も不明だった。
- アプローチ
- 緑膿菌とヒト細胞で効果と毒性を調べ、MexBとPAβNの複合体をクライオ電顕と結晶構造で解析した。
- 結果
- どちらの構造でもMexBはTight型で、PAβNは結合腔の中の別々の位置にあった。
- わかったこと
- PAβNは空洞内で柔軟な形を保ち、阻害剤というより競合する基質として通過するらしい。
Highlights
PAβNは、クライオ電顕構造では深い結合ポケットに、結晶構造ではその手前の中間的な位置にあった。AcrBの既存構造の位置と合わせると、細胞に取り込まれた分子が空洞の通り道を進む途中の位置を並べて見ているらしい。
“PAβN-AcrB is located at the entry of channel 2, at the beginning of the PBP, PAβN-cryo is in the DBP like most of the substrates that have been solved in complex with RND transporters so far, and PAβN-xtal is in an intermediate position, in between the PBP and the DBP before the switch-Loop.”Discussion
PAβNの形は3つの構造でそれぞれ違い、空洞の中でも柔軟だった。新しい阻害剤を設計するとき、基準となるPAβNは固い結合をする分子ではなく、通過する基質に近い性質を持つと考える必要がある。
“leaving no doubt that PaβN is not effluxed in a rigid conformation.”Discussion
結晶では洗剤DDMが深いポケットを占め、PAβNは別の位置に入った。ナノディスクに再構成すると洗剤が除かれ、深いポケットでPAβNを観察できた。
“The preparation of MexB insertion in the nanodiscs requires the use of biobeads that suck the detergent, forcing the protein to surround itself with lipids, but sucking also all the molecules of detergent present inside the cavities, releasing the DBP.”Results
Lab Notes
- 発現系
- MexB-D407N（8×His）を大腸菌 C43(DE3)ΔacrAB で発現
- コンストラクト
- プロトン輸送を止める D407N 変異体
- 精製
- DDM で可溶化し、Ni-NTA とゲルろ過で精製
- 結晶化／グリッド作製
- MSP1E3D1・POPC のナノディスクに再構成し、PAβN 30 µM を加えてグリッド化。結晶は PEG 400 で作り、PAβN に浸漬
- データ収集・解析
- Titan Krios G4 で 10,483 枚を撮影し、cryoSPARC で 2.31 Å に再構成
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